在水产动物病原微生物检测中的应用

　　豚鼠气单胞菌是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一，能导致水产动物败血症、肠炎、体表溃疡和竖鳞病。辛志明制备出3株抗豚鼠气单胞菌的单克隆抗体，并对单抗1F10进行了胶体金标记，制备了豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条。该方法特异性强，检测灵敏度为100万CFU/mL，结果显示时间小于5min，适用于基层生产推广应用。黄艺丹等采用高度特异的抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体3F3和2C9C3及胶体金标记技术，通过双抗体夹心法(单克隆抗体-抗原-单克隆抗体)，建立了超灵敏胶体金检测方法。该法可检测活菌液和灭活菌液，   低检出率为1.71万CFU/mL，特异性高，重复性好，检测时间快，操作简便结果直观，为水产上豚鼠气单胞菌病的检测提供了   便捷和准确的方法。
　　温和气单胞菌(A.sobria)是一种淡水菌，常见于池塘、湖泊、河流等多种水域，流行性强，水产动物感染后死亡率高，严重危害水产养殖业。梁明龙建立的检测温和气单胞菌的胶体金试纸条可在10min内完成对温和气单胞菌的检测，   小检出限为100万CFU/mL。该检测方法、准确、灵敏、操作简便，适合非人员在现场检测。
　　嗜水气单胞菌(A.hydrophila)广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是一种典型的人一兽一鱼共患病病原菌，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻。辛志明等用直径20nm的胶体金标记抗嗜水气单胞菌单克隆抗体1A5，并以其作为检测抗体喷涂在金标垫上，以抗嗜水气单胞菌单克隆抗体1F3和羊抗鼠抗体作为捕获抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的T线和C线上，建立了检测嗜水气单胞菌的胶体金试纸条，并用该试纸条检测灭活与血清混合的模拟样本，显示该试纸条特异性强，灵敏度可达10万CFU/mL，检测时间小于5min，适合基层生产一线的临床检测。
　　迟缓爱德华菌又称迟钝爱德华氏菌，是鱼类、两栖类、爬行类动物的重要致病菌。由该菌引起的水生动物称为迟缓爱德华菌病，可导致较严重的经济损失，为我国的3类水生动物疫病。秦璞，胡晓等制备了迟钝爱德华菌胶体金检测试纸并对其性能进行检测，结果表明所研制的试纸特异性良好，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌等常见或病原菌进行检测未出现交叉反应；敏感度达到10万CFU/mL，反应时间仅为5~10min，可以用于感染迟钝爱德华氏菌大菱邮腹水的检测，具有操作简便、特异性强、等特点。辛志明以纳米胶体金颗粒标记抗迟缓爱德华菌单克隆抗体3A7，并以其作为检测抗体，以抗迟缓爱德华菌单克隆抗体4F11和羊抗鼠抗体作为捕获抗体，建立了迟缓爱德华菌的胶体金免疫层析检测方法。该试纸条灵敏度可达10万CFU/mL，且特异性强，检测时间低于20min，适合基层生产推广应用。
　　哈维弧菌(Vibrio　harveyi)是发光性弧菌病的主要病原菌，能够感染多种海洋脊椎动物和无脊椎动物。Sithigorngul等制备了两株抗哈维氏弧菌的单克隆抗体(VH4、VH5)和一株多克隆抗体，并将单克隆抗体VH4进行了胶体金标记，作为检测抗体，多克隆抗体作为捕获抗体，建立了检测哈维氏弧菌的胶体金试纸条。该方法的检测限略低于斑点杂交，大约为100万CFU/mL。但是将哈维弧菌在T培养基中培养6h以上，可以将灵敏度提高到1~10CFU/mL。该方法简单、方便，普通人员可以在没有设备的池塘直接进行检测。
　　创伤弧菌(V.vulnificus)是海水养殖虾、蟹等水生动物中常见的致病菌，广泛分布于海水中。严志敏等用13nm的胶体金颗粒标记创伤弧菌多克隆抗体喷涂在金标垫上，采用夹心法即在检测线上喷涂多克隆抗体，质控线上喷涂二抗，建立了检测创伤弧菌的胶体金检测试纸条。该试纸条特异性强、对创伤弧菌的   低检出限为200万CFU/mL，该试纸条40C可保存4个月之久，检测时间仅需20min，适合临床及现场检测。
　　霍乱弧菌(V.Cholerae)是引起人类霍乱的病原体。海洋甲壳类动物可作为其宿主，散播病原菌，造成霍乱流行。何艳玲等研究了采用夹心法，即用胶体金标记霍乱弧菌单克隆抗体，NC膜的检测线和质控线上分别包被霍乱弧菌多克隆抗体和羊抗鼠IgG，并通过对试纸材料的优化处理，建立检测食品中O1群霍乱弧菌的胶体金免疫层析方法。该方法检测的灵敏度为10万CFU/mL，特异性良好，假阳性率为6.25%，适用于对水产品O1群霍乱弧菌的检测。谢昭聪等也采用夹心法建立了水产品中霍乱弧菌的检测方法，该试纸条的   低检出量为10万CFU/mL，通过改良增菌培养液成分，提高待检菌繁殖能力，即可检测霍乱弧菌污染菌数较少的鱼贝类。
　　自20世纪90年代对虾白斑综合征在全世界范围爆发以后，对虾白斑综合征病毒(WSSV)己成为对虾养殖业危害   大的病毒病原之一。
　　Sithigorngul等以胶体金标记的抗WSSV结构蛋白VP28的单克隆抗体W29作为检测抗体，以抗WSSV重组蛋白Rvp28的多克隆抗体W29和羊抗鼠IgG作为捕获抗体，制备了检测WSSV的胶体金试剂条，虽然其检测灵敏度比Dot-blot低4倍，比PCR低200万倍，但是该试纸条特异性强、不需要的设备仪器，而且检测所需时间短，15min便可出结果。Cheng等用大肠杆菌纯化表达抗
　　WSSV重组蛋白VP(19+28)的多克隆抗体，并将纯化后的多克隆抗体进行了胶体金标记用为检测抗体，以未标记的抗WSSV重组蛋白VP(19+28)多克隆抗体和羊抗兔IgG作为捕获抗体分别喷涂在NC膜的T线和C线上，建立了WSSV胶体金免疫层析试纸条检测方法，其   低检测限为10ng/mL，特异性强。此外，Wang等用胶体金标记的斑点免疫渗滤法(DIGFA)检测WSSV，该方法简单便捷，不需要任何设备，3min内出结果，方便池塘养殖检测。
　　对虾黄头病病毒(YHV)，1990年在泰国   报道，现己成为危害对虾养殖业的三大病毒病病原(对虾白斑病毒(WSSV)、陶拉综合征病毒(TSV)、对虾黄头病病毒(YHV))之一。Sithigorngul等以胶体金标记的抗YHV结构蛋白p20的单克隆抗体Y19作为检测抗体喷涂在金标垫上、抗重组蛋白rp20的多克隆抗体和羊抗鼠IgG作为捕获抗体分别喷涂与NC膜的T线和C线上，建立了检测YHV的胶体金免疫层析试纸条，该试纸条的灵敏度比一步法RT-PCR低500倍，但高于Dot-blot，可用于的YHV或YHV爆发的初步检测，因其单抗Y19与鳃联病毒(GAV)有交叉反应，因此该试纸条也可用于GAV的检测。
　　淋巴病毒(LCDV)以其传染性强、潜伏期长等特点己成为危害我国牙邮养殖业的一大难题。Sheng等以胶体金标记的抗LVCV的单克隆抗体2D11作为检测抗体喷涂在金标垫上、单克隆抗体1A8和羊抗鼠IgG作为捕获抗体分别喷涂与NC膜的T线和C线上，建立了检测LVCV的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条特异性强，灵敏度可达1μg/mL，检测时间低于10min，该试纸条在室温下可保存6个月，4℃条件下可保存1年。